Estudio comparativo inactivante de distintas colectas phyllanthus (-VHB)

Estudio comparativo de la capacidad inactivante de distintas colectas de la planta phyllanthus orbicularis

Estudio comparativo de la capacidad inactivante de distintas colectas de la
planta phyllanthus orbicularis

Dra. Gloria del Barrio Alonso,1
Lic. Annele Roque Quintero1 y Lic. Martha Arias1

Resumen

Se estudió la inactivación del AgsHB por extractos de 2 colectas de Phyllanthus
orbicularis realizadas en diferentes épocas del año (Marzo/94 y Octubre/94)
en 34 sueros positivos a este marcador, y se compararon estos resultados con
los obtenidos para la colecta Agosto/93, con el objetivo de conocer la influencia
de la época de colecta en la presencia de la actividad anti-hepatitis B de la
planta. Todas las concentraciones ensayadas (100, 50 y 25 mg/mL) disminuyeron
los valores de absorbancia en los sueros, y se logró una seroconversión a negativos
estadísticamente significativa, con excepción de lo ocurrido para las concentraciones
de 25 y 12,5 mg/mL de la colecta Octubre/94. La cantidad de sueros negativos
fue proporcional a las concentraciones utilizadas. Se observaron diferencias
estadísticas entre las colectas Agosto/93 y Octubre/94. Estos resultados sugirieron
que podían ocurrir alteraciones en la presencia o concentración de los posibles
componentes activos de P.orbicularis producto de la influencia de factores externos
como lo son las condiciones climáticas.


DeCs: EXTRACTOS VEGETALES/uso terapéutico; PLANTAS MEDICINALES; MEDICINA HERBARIA;
ANTIGENOS DE LA HEPATITIS B; VIRUS DE LA HEPATITIS B/efectos de drogas; HEPATITIS
B/quimioterapia.

Summary

The authors studied the inactivation of AgsHB by extracts from 2 harvests of
Phyllanthus orbicularis, carried out at different times of the year (March/94
and October/94) in 34 positive sera at this marker. These results were compared
with those obtained for the harvest of August/93 to know the influence on harvesting
time on the presence of the anti-hepatitis B activity of the plant. All the
assayed concentrations (100, 50, and 254 mg/mL) reduced the absorbency values
in sera, achieving a statistically significant seroconversion to negatives,
excepting what happened for concentrations of 25 and 12,5 mg/mL of the harvest
of October/94. The quantity of negative sera was proportional to the concentrations
used. There were statistically differences between the harvests of August/93
and October/94. These results suggested that alterations may occur in the presence
or concentration of the possible active components of P. orbicularis due to
the influence of external factors, such as the climatic conditions.


Subject headings:PLANT EXTRACTS/therapeutic use; PLANTS, MEDICINAL; MEDICINE,
HERBAL; HEPATITIS B ANTIGENS; HEPATITIS B VIRUS/drug effects; HEPATITIS B/drug
therapy.


El virus de la hepatitis B (VHB) es uno de los agentes causantes de la hepatitis
e infecta a más de 300 millones de personas en el mundo, con alto riesgo de
desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.1
Es por ello que el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos presenta gran importancia
para el manejo de estos pacientes.


La actividad anti-hepatitis de plantas del género Phyllanthus ha sido estudiada
por diferentes investigadores,2-4 destacándose
los trabajos realizados con la especie Phyllanthus amarus, cuyo extracto acuoso
inhibe la actividad DNA polimerasa endógena del VHB e interfiere en la unión
del AgsHB con el anticuerpo correspondiente.5


En Cuba, se han estudiado algunas especies Pyllanthus endémicas, cuyos extractos
etanólicos son capaces de inactivar al antígeno de superficie del VHB (AgsHB).6
En el presente trabajo se estudió la inactivación del AgsHB por el extracto
proveniente de 2 colectas de P. orbicularis, realizadas en diferentes épocas
del año y se compararon estos resultados con los obtenidos para la colecta Agosto/93
con el objetivo de conocer la importancia relativa de la época de colecta en
la presencia de actividad anti-hepatitis B de la planta.

Métodos

Colecta de plantas

En los meses de marzo y octubre de 1994 se colectaron las plantas de P. orbicularis
con la ayuda de la Dra. Rosalina Berazaín, especialista del Jardín Botánico
Nacional, quien contribuyó a la localización e identificación de las mismas.

Preparación de los extractos

Se prepararon extractos acuosos a partir de cada colecta (Marzo/94 y Octubre/94)
de P. Orbicularis y se empleó la parte aérea de las plantas. La extracción se
realizó a 100 oC durante 4 h y posteriormente la mezcla se filtró y centrifugó
a 1 000 rpm por 10 min. a 25 oC. El sobrenadante se liofilizó y se conservó
a temperatura ambiente hasta su uso.

Ensayo de inactivación in vitro

El liofilizado de cada extracto se resuspendió en PBS (solución buffer fosfato
de sodio, pH-7,2) a concentraciones de 100, 50, 25 y12,5 mg/mL. Cada colecta
fue evaluada frente a 34 sueros positivos al AgsHB, procedentes del Instituto
de Gastroenterología y al Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Ciudad
Habana; para ello se mezcló cada una de las concentraciones con igual volumen
de suero positivo al AgsHB y se incubó a 35 ± 1 oC durante 48 h. En todos los
ensayos se emplearon controles de suero, consistentes en la mezcla de iguales
volúmenes de suero y PBS, así como de controles de extracto, mezcla de iguales
volúmenes de extracto y PBS, para cada colecta a cada una de las concentraciones
empleadas. La detección del AgsHB se realizó mediante ELISA tipo sandwich, a
través de los estuches diagnósticos de la Empresa de Productos Biológicos “Carlos
J. Finlay”. La capacidad inactivante se manifiesta como un decremento en la
absorbancia a 492 nm de la muestra con respecto al control. Se consideraron
negativas las muestras de sueros tratados cuyos valores de absorbancia están
por debajo del valor límite establecido para la placa.

Ensayo estadístico

Los resultados fueron procesados a través del test de G para tablas de contingencia.7

Resultados

La presencia del AgsHB se evaluó para cada uno de los tratamientos realizados
con las colectas de Marzo/94 y Octubre/94. Los resultados obtenidos mostraron
un comportamiento similar en el por ciento de sueros que disminuyen su valor
de absorbancia ( > 85 %), al ser tratados con las 3 concentraciones, para ambas
colectas mayores, (figura 1).


El por ciento de sueros negativos también difiere para ambas colectas con las
diferentes concentraciones empleadas (figura 2). En todos los casos, con excepción
de la con centración 12,5 mg/mL de la colecta Octubre/94, hubo sueros negativos,
observándose los mayores por cientos para la concentración 100 mg/mL de ambas
colectas, 82,3 % para Marzo/94 y 85,3 % para Octubre/94.


A partir de estos resultados se realizó el análisis estadístico de los mismos,
se comparó el grupo control de sueros no tratados con el número de sueros positivos
y negativos para cada concentración, en ambas colectas, mediante el test G (tabla
1). Para Marzo/94 se observaron que todas las concentraciones difieren estadísticamente
del grupo control, mientras que para Octubre/94 las 2 concentraciones menores
no presentan diferencias significativas con respecto al grupo control (tabla
1).

Fig 1. Comportamiento de la disminución de los valores de densidad
óptica de los sueros tratados con diferentes concentraciones de los extractos
de colectas marzo/94 y octubre/94.

Fig 2. Seroconversión a negativos de los sueros tratados con
los extractos de las colectas de marzo/94 y octubre/94 de Phyllanthus orbicularis.

Tabla 1. Comparación por test G del número de sueros negativos
y positivos en cada concentración con respecto a los controles.

Comparación	Marzo/94 Valor de G	Octubre/94 Valor de G
Control Vs C1	53,748***	57,484***
Control Vs	C2 41,051***	26,281***
Control Vs C3	8,168***	2,672 ns
Control Vs C4	3,935*	0,000 ns

C1-100 mg/mL C2-50 mg/mL C3-25mg/mL C4-12,5 mg/mL

El análisis estadístico de los resultados obtenidos para cada colecta por separado,
mediante test G (G = 49,894*** para Marzo/94 y G = 79,904*** para Octubre/94),
permitió conocer que existían diferencias altamente significativas en cuanto
a la frecuencia de obtención de individuos seronegativos, de un total de 34,
entre las diferentes concentraciones para ambos casos.


La comparación de cada par de concentraciones (tabla 2) mostró que solo no
existían diferencias significativas entre las concentraciones de 100 y 50 mg/mL
y 25 y 12,5mg/mL para Marzo/94 y entre 25 y 12,5 mg/mL para Octubre/94.

Tabla 2. Comparación por test G de las concentraciones para
determinar dónde se encuentran diferencias significativas en ambas colectas.

Comparación	Marzo/94 Valor de G	Octubre/94 Valor de G
C1 Vs C2	0,739 n.s	7,105**
C1 Vs C3	22,615***	37,537***
C1 Vs C4	30,935***	57,484***
C2 Vs C3	13,759***	11,931***
C2 Vs C4	20,662***	26,281***
C3 Vs C4	0,382ns	2,672ns

C1-100 mg/mL        C2-50
mg/mL      C3-25 mg/mL        
C4-12,5 mg/mL

Posteriormente se realizó una comparación entre los resultados obtenidos con
estas 2 colectas y los correspondientes a Agosto/93, que habían sido previamente
evaluados (en publicación).


El análisis por test G de la obtección de sueros negativos con el objetivo
de determinar en cada concentración dónde se encuentran las diferencias entre
las colectas (tabla 3), mostró que no existen diferencias estadísticas entre
las mismas cuando se emplean 100 mg/mL del extracto, por otro lado la colecta
Agosto/93 no difiere de las otras cuando se utiliza 12,5 mg/mL, mientras que
Octubre/94 y Marzo/94 solo se diferencian significativamente a esta concentración.
Al comparar el comportamiento total de las 3 colectas entre sí, se observa que
sólo hay diferencias significativas entre Agosto/93 y Octubre/94.

Tabla 3. Test para analizar en cada concentración dónde se encuentran
las diferencias entre las colectas

Valores de G
Comparación	C1	C2	C3	C4	Conjunto
Agosto Vs Marzo	0,117 ns	7,613*	4,103*	0,142 ns	3,121 ns
Agosto Vs Octubre	0,000 ns	17,313***	10,388**	2,362 ns	9,599*
Octubre Vs Marzo	0,000 ns	1,564 ns	0,919 ns	3,935*	7,495 ns
Conjunto	0,472 ns	20,662***	12,919**	7,395*	12,95*

C1-100 mg/mL         C2-50
mg/mL       C3-25 mg/mL       
C4-12,5 mg/mL

Discusión

El presente trabajo contribuye al estudio de la actividad biológica de especies
del género Phyllanthus, e indica la presencia de compuestos capaces de inactivar
el AgsHB in vitro en el extracto acuoso de la especie Phyllanthus orbicularis,
lo que coincide con lo reportado por Thyagarajan y otros, en 1982, Mehrota y
otros, en 1991 y Del Barrio y otros., en 1995, para otras especies del género2,8,9
así como por este mismo autor para el extracto alcohólico de esta especie.6



Los resultados obtenidos demuestran que todas las concentraciones ensayadas
son capaces de disminuir los valores de absorbancia en los sueros, lográndose
una seroconversión a negativos estadísticamente significativa en todos los casos,
con excepción de las concentraciones 25 mg/mL y 12,5 mg/mL de la colecta Octubre/94.



Se observó una relación entre la cantidad de sueros negativos y las concentraciones
del extracto, siendo 100 y 50 mg/mL las más efectivas para ambas colectas, lo
que coincide con lo obtenido en la investigación para Agosto/93. El análisis
estadístico de los resultados obtenidos con estas concentraciones muestra que
existen diferencias muy significativas entre las correspondientes a Octubre/94,
mientras que las de Marzo/94 no difieren estadísticamente, similar a lo que
sucede con Agosto/93.


El estudio estadístico realizado permitió conocer en la comparación de las
3 colectas, que existen diferencias significativas, cuando se evalúan los resultados
totales, entre Agosto/93 y Octubre/94, lo que no ocurre cuando se compara cada
uno de ellos con Marzo/94. Estas diferencias, debida a las concentraciones de
50 y 25 mg/mL, fundamentalmente, así como las observadas entre Agosto/93 y Marzo/94
para las mismas concentraciones, pueden deberse a alteraciones en el metabolismo
de las plantas producto de la influencia de factores internos y/o externos,
como su edad fisiológica, los componentes nutritivos del suelo, la época del
año en que se realiza la colecta. Estos aspectos podrían afectar la proporción
de compuestos químicos en la planta o la presencia de alguno(s) de ellos.


Para este trabajo se tomaron plantas de la misma zona y similar estado fisiológico,
por lo cual se evita la interferencia de los 2 primeros factores en los resultados.


Los datos meteorológicos correspondientes a las fechas de colecta (datos no
publicados) muestran variaciones en las condiciones climáticas, por lo que esto
pudiera influir sobre el extracto, alterando, quizá, algún metabolito o su acumulación.
Tamizajes fitoquímicos preliminares de estos extractos (datos no publicados),
muestran la existencia de iguales compuestos químicos en los 3 casos, es por
ello que se considera la influencia de la concentración del posible compuesto
activo como uno de los factores fundamentales que han intervenido en estos resultados.



Si bien el mecanismo de acción del extracto sobre el virus no se puede determinar
por estudios in vitro, mediante los resultados obtenidos en el presente trabajo
se puede afirmar que el extracto acuoso de la planta Phyllanthus orbicularis
posee actividad inactivante frente al AgsHB, puesto que en todas las colectas
hubo efectividad. Es recomendable continuar la evaluación de esta especie mediante
estudios in vitro e in vivo que permitan el análisis del comportamiento de otros
marcadores virales, así como conocer el principio activo para obtener compuestos
con fines terapéuticos.