Inactivación in vitro del Ags HB por extractos de plantas del género Phyllanthus

Revista Cubana de Medicina Tropical - Inactivación in vitro del Ags HB por extractos de plantas del género Phyllanthus (VHB)

Inactivación in vitro del Ags HB por extractos de plantas del género Phyllanthus

Lic. GLORIA DEL BARRIO ALONSO,¹ Lic. OMELIO CABALLERO PÉREZ² y Lic. PABLO CHEVALIER³

RESUMEN

Se estudiaron 3 especies del género Phyllanthus
procedentes de la zona oriental de Cuba con el fin de determinar la
capacidad inactivante del antígeno de superficie (Ags HB) del virus
hepatitis B in vitro . Para ello se prepararon extractos
alcohólicos de cada especie y de diferentes partes de dichas plantas,
con las cuales se trataron sueros de pacientes positivos al Ags HB.
Los resultados demuestran que las especies estudiadas poseen la
propiedad de inactivar dicho antígeno entre el 93 y el 97 % de los
sueros ensayados. El análisis de la capacidad de inactivación de las 3
partes del Phyllanthus chamaecristoides reveló una mayor
actividad en los extractos de tallos (97 %), con un comportamiento
similar en las 2 temperaturas de incubación utilizadas. Se observa
presencia de flavonoides en el extracto de esta especie.


Palabras clave: PLANTAS MEDICINALES; ANTIGENOS DE SUPERFICIE/aislamiento y purificación.

INTRODUCCION

Las infecciones causadas por el virus de la hepatitis B (VHB)
representan un importante problema de salud mundial,1,2 por lo que las
investigaciones en el campo de los agentes antivirales muestran un
interés actual, en particular los estudios de productos naturales de
origen vegetal. En la práctica médica tradicional se han utilizado para el tratamiento de las ictericias y otras enfermedades.3,4

Los estudios realizados con Phyllanthus niruri Linn
demuestran la propiedad de inactivación del Ags HB del VHB.5 Esta
misma especie es capaz de inhibir la DNA polimerasa endógena del VHB y
del virus de la hepatitis B de la marmota.6

En el presente trabajo se evalúa la capacidad inactivante del Ags HB mediante ensayos in vitro, por 3 especies de Phyllanthus procedentes de la zona oriental de Cuba.

MATERIAL Y METODO

Preparación de los extractos. Se prepararon extractos alcohólicos a partir de diferentes partes de las plantas cuyas especies fueron: Phyllanthus chamaecristoides, Phyllanthus formosus y Phyllanthus microdictyus. El
procedimiento de extracción se realizó durante 24 horas a temperatura
ambiente.7 Posteriormente se filtró y concentró en rotoevaporador. Cada
muestra se liofilizó en bulbos de 4 mL.

Inactivación in vitro. Teniendo en cuenta la especie y la parte de la planta sometida a ensayo, los extractos obtenidos: tallo (P. chamaecristoides), raíz y tallo (P. formosus) y raíz y hojas (P. microdictyus),
se evaluaron frente a 30 sueros humanos positivos al Ags HB
procedentes del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Ciudad
de La Habana, según el método de Thyagarajan et al .4 para lo cual cada muestra de Phyllanthus se mezcló con un volumen igual de suero Ags HB positivo y se incubó a 36 oC durante 48 horas.

En la evaluación de los extractos obtenidos a partir del tallo, raíz y hojas de P. chamaecristoides
se utilizaron 30 sueros humanos positivos al Ags HB procedentes del
Instituto de Gastroenterología de Ciudad de La Habana, teniendo en
cuenta a su vez la acción de 2 temperaturas: 36 oC y temperatura
ambiente (28-30 oC) durante el proceso de incubación.

En
todos los ensayos se emplearon controles, consistentes en la mezcla de
iguales volúmenes de suero Ags HB positivo y PBS, que se incubaron por
el tiempo y temperatura antes señaladas.

Una vez
transcurrido el tiempo de incubación se procedió a la detección del Ags
HB presente en las diferentes muestras mediante la técnica ELISA tipo
sandwich, para lo cual se utilizaron estuches diagnósticos de la
Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay".

Lectura.
La reacción inactivante se expresa como el decrecimiento en la
absorbancia de la muestra con respecto al control, se consideraron
negativos aquellos valores que tras el tratamiento están por debajo del
valor de densidad óptica (DO) límite establecido.

Ensayo estadístico. Los resultados se pro- cesaron empleando la prueba estadística chi-cuadrado.

Ensayo fitoquímico y cromatográfico preliminar. Con el extracto procedente de P. chamae cristoides
se procedió a realizar el ensayo de Shinoda, cuyo resultado fue
corroborado mediante cromatografía en placa delgada de sílica gel. Una
vez aplicada la muestra, las placas se corrieron en el sistema de
solvente polar: cloroformo-metanol-agua (35:15:2,5 mL) en una cámara
cromatográfica, ésta fue revelada con iodo y vainillina-HCLO4 al 1 %,
como segundo revelador.

RESULTADOS

Los resultados del experimento de inactivación in vitro
del Ags HB por los extractos procedentes de las 3 especies en estudio
se aprecian en la tabla, donde se representan los valores de DO
obtenidos para cada muestra ensayada.
TABLA. Inactivacion in vitro del AgHBs por extracto de Phyllanthus

	Valores de DO (492 nm)
	Phyllanthus chamaecristroides	Phyllanthus formosus	Phyllanthus formosus	Phyllanthus microdictyus	Phyllanthus microdictyus
Control	(tallo)	(tallo)	(raiz)	(hoja)	(raiz)
0,655	0,111	0,099	0,102	0,100	0,100
1,281	0,093	0,098	0,097	0,092	0,111
0,748	0,108	0,110	0,096	0,099	0,097
1,190	0,092	0,109	0,094	0,101	0,102
1,348	0,133	0,102	0,106	0,095	0,091
0,627	0,163	0,147	0,108	0,128	0,133
0,893	0,092	0,090	0,093	0,100	0,137
1,269	0,102	0,101	0,096	0,094	0,097
0,847	0,083	0,091	0,088	0,086	0,086
0,739	0,116	0,083	0,082	0,087	0,112
0,278	0,087	0,117	0,091	0,148	0,089
0,433	0,091	0,091	0,095	0,080	0,085
0,491	0,084	0,093	0,086	0,086	0,088
0,543	0,098	0,087	0,088	0,088	0,088
0,659	0,085	0,101	0,097	0,091	0,100
0,572	0,102	0,094	0,098	0,100	0,091
0,652	0,100	0,093	0,097	0,104	0,098
1,574	0,099	0,111	0,145	0,094	0,113
1,023	0,096	0,111	0,106	0,102	0,157
1,470	0,100	0,108	0,099	0,100	0,105
1,281	0,093	0,109	0,099	0,098	0,105
0,242	0,106	0,102	0,101	0,100	0,108
0,501	0,089	0,097	0,099	0,097	0,095
0,201	0,102	0,089	0,099	0,091	0,109
0,788	0,101	0,092	0,093	0,097	0,096
1,750	0,105	0,103	0,103	0,096	0,108
0,724	0,099	0,107	0,109	0,105	0,105
1,343	0,100	0,109	0,102	0,107	-
1,173	0,104	0,101	0,111	0,103	0,111
0,781	0,099	0,096	0,095	0,096	0,102

  En
todos los casos se evidencia una disminución de los valores de DO, y
es estadísticamente significativo (p < 0,01) el número de sueros que
se convierten en negativos para las 3 especies. En la figura 1 se
representan los porcentajes de sueros que se convierten en negativos
tras los tratamientos con cada especie y parte de la planta estudiada.


Los sueros positivos tratados con los extractos de las 3 partes de P. chamaecristoides
mostraron una disminución de los valores de DO, independientemente de
la temperatura de incubación utilizada. Los resultados obtenidos en la
inactivación in vitro con los extractos de cada una de las partes de dicha especie se observan en la figura 2.

El
ensayo de la reacción de Shinoda resultó positivo, lo que permite
afirmar la presencia de flavonoides. El ensayo cromatográfico
preliminar mostró 2 manchas en el revelado con iodo y 4 en el revelado
con vainillina, lo cual corrobora la presencia de flavonoides.

DISCUSION

Diversos estudios sobre las propiedades antivirales de extractos de P. niruri Linn (más tarde clasificada como Phyllanthus amarus ) han sido descritos por distintos autores.4,5,8 Thyagarajan et al. 5
demostraron que extractos obtenidos a partir del sistema radicular y
del tallo de esta especie eran capaces de inactivar el Ags HB, evaluando
ello por la contrainmunoelectroforesis y hemaglutinación
reverso-pasivo (RPHA). Mehrotra et al.8 utilizando la técnica ELISA evaluaron los efectos in vitro sobre los Ags HB, Age HB y el ADN del VHB, y tuvieron resultados positivos frente a éstos, Por otra parte, Shead9
al utilizar el virus de la hepatitis B del pato en su hospedero
específico, mostró que extractos provenientes de 5 especies de Phyllanthus existentes en Australia, inhibían la ADN polimerasa de dichos virus. En el presente trabajo se demuestra que las especies P. chamaecristoides, P. formosus y P. microdictyus,
endémicas de Cuba, poseen la propiedad de inactivar el Ags HB del
virus de la hepatitis B, al lograr disminuir dicho antígeno en el 100 %
de los sueros estudiados, así como valores de seronegatividad
altamente significati vos (93-97 %).

Dadas las características de la especie P. chamaecristoides
y a su más fácil o asequible colecta, ésta se utilizó para evaluar
los extractos provenientes de cada una de sus partes, se demostró que
el extracto procedente del tallo presenta el mayor efecto in vitro
y resultó estadísticamente significativo (p < 0,01) al compararlo
con el extracto de hojas. El extracto proveniente de raíz resultó
igualmente activo, no existen diferencias significativas con respecto
al tallo pero sí en relación con el extracto de hojas, quien mostró la
menor actividad frente al antígeno.

Al emplear el
procedimiento de inactivación a 2 temperaturas diferentes se evidencia
un comportamiento semejante, no existen diferencias estadísticamente
significativas.

Los resultados aquí obtenidos confirman la
importancia que presenta este género para los estudios de propiedades
antivirales y en especial frente al VHB.

La ulterior confirmación de estos resultados preliminares precisan ensayos frente a otros marcadores virales in vitro, así como ensayos in vivo con el virus de la hepatitis B de la marmota u otros sistemas establecidos.